Projet ANR Clicteam – DISCO SOLEIL

Synopsis du projet 

Le projet CLICTEAM s’est concentré sur l’élaboration d’un modèle de la paroi végétale, composé de suspensions concentrées (> 10 %) et organisées en phase cristal liquide afin de comprendre le comportement d’une enzyme dans ces conditions complexes. Le système comprend des nanocristaux de cellulose et une hémicellulose, le xyloglucane. La glucanase, une enzyme dont le xyloglucane est le substrat, a ensuite été introduite dans ces systèmes modèles et localisée par microscopie à fluorescence accessible sur la ligne de lumière DISCO du synchrotron SOLEIL. Nous avons pu montrer que l’adsorption « à plat » de chaînes courtes de xyloglucane sur la cellulose avait un fort impact sur la glucanase. En effet, cette adsorption modifie l’interaction entre la cellulose et l’enzyme d’attractive à répulsive, entraînant une migration de l’enzyme dans les régions les moins concentrées de nos modèles et accélérant significativement sa diffusion. Ce résultat pourrait être relié à une optimisation de l’utilisation de l’enzyme en conditions réelles, in planta.

Description du projet

L’utilisation d’enzymes pour la biomasse présente de nombreux avantages dans le cadre du développement de la bioéconomie. En effet, leur emploi s’effectue dans des conditions physico-chimiques généralement assez douces (température/pression proches de l’ambiante, réaction en conditions aqueuses) et ne nécessite pas l’utilisation d’autres produit permettant d’en limiter l’impact environnemental. La transformation par voie enzymatique bénéficie aussi d’une large gamme d’enzymes. Telle une boite à outils chacune est adaptée à un substrat permettant un grand nombre de réactions. Les enzymes donnent ainsi accès à une vaste gamme de produits de réactions possibles. La compréhension du mode d’action d’enzymes sur la biomasse est donc un objectif important, à la fois d’un point de vue fondamental et appliqué. Son étude permet aussi de mieux comprendre le comportement des enzymes naturellement présentes dans les végétaux.

Cette étude se fait généralement en conditions modèles et diluées, afin de faciliter la compréhension des mécanismes observés. Malheureusement, ces conditions peuvent être éloignées de celles qui règnent dans la paroi végétale, pouvant entraîner un manque de transposabilité des résultats à des conditions réelles. C’était là le premier enjeu de ce projet, qui visait à élaborer un modèle simplifié de la paroi cellulaire végétale (PCV) présentant certaines caractéristiques identifiées comme essentielles, à savoir : une concentration en matière solide élevée (au-dessus de 10 %), une forme d’organisation multiéchelles, et l’intégration d’au moins deux polysaccharides naturellement présents dans la PCV. Le modèle que nous avons choisi se compose de cellulose qui est le principal biopolymère de la PCV, sous forme de nanocristaux de cellulose (CNC) qui sont les nanoparticules élémentaires de la cellulose. Lorsque ces CNCs sont préparés sous formes de suspensions aqueuses à haute concentration, ils forment une phase cristal liquide dite cholestérique (Figure 1. gauche), permettant ainsi d’obtenir un système concentré et organisé, comme souhaité. Le deuxième polysaccharide ajouté est le xyloglucane (XG), une hémicellulose hydrosoluble dont l’interaction avec la cellulose fait l’objet de nombreuses études dans l’équipe NANO, et qui a un rôle crucial dans la PCV. Ces suspensions organisées ont été étudiées sous forme de gouttelettes car leur très faible volume permet de réduite la quantité d’enzyme nécessaire (voir Figure 1, droite).

Figure 1. de gauche à droite : image TEM de CNCs ; structure tridimensionnelle de l’organisation cholestérique des CNCs ; aspect d’une goutte de CNCs organisée, et sa représentation schématique.

L’action de l’enzyme dans ces systèmes modèles a été étudiée par suivi des produits de dégradation, mais aussi d’un point de vue colloïdal pour comprendre sa diffusion dans des milieux concentrés. Cette dernière étude a été conjointement réalisée par les équipes NANO et PVPP en collaboration avec l’ESPCI - Paris (experts en microfluidique et cristaux liquides) et le synchrotron SOLEIL. En effet, nous devions localiser l’enzyme dans les gouttelettes sans la modifier par des marqueurs impactant potentiellement son activité enzymatique. C’est là la spécialité de la ligne de lumière DISCO de SOLEIL, qui utilise une source UV-lointain (DUV) pour quantifier en microscopie à fluorescence la concentration d’espèces sans les marquer chimiquement, en tirant profit de l’autofluorescence des protéines excitées à ces longueurs d’ondes.

Nous avons donc préparé des dispositifs microfluidiques sur mesure, permettant l’observation de la répartition de l’enzyme étudiée, une glucanase dont le XG est le substrat, dans les gouttelettes. De telles expériences sur grand instrument ont nécessité un long travail de mise au point du dispositif expérimental. Les premières observations sur des suspensions sans XG ont montré une distribution homogène de la glucanase dans les gouttelettes¹. Un résultat surprenant fut l’observation d’une interaction entre la glucanase et les CNCs, alors que ces derniers ne sont pas son substrat. Par contre nous avons observé qu’en présence de XG, l’enzyme se concentrait alors dans le cœur moins concentré des gouttelettes (Figure 2, a-d). En parallèle, des expériences de diffusion de l’enzyme sur ces suspensions ont montré que l’enzyme diffusait bien plus rapidement dans des suspensions de CNCs contenant du XG (Figure 2, e)². Initialement déroutant, ce résultat a pu être expliqué en corrélant avec des expériences de microbalance à quartz qui ont montré une interaction beaucoup plus significative de l’enzyme sur des CNCs que sur des CNCs couverts de XG (CNC-XG). Les résultats obtenus sur DISCO proviennent donc d’une différence de nature de l’interaction entre glucanase et CNC (attractive) par rapport à glucanase sur CNC-XG (répulsive). L’enzyme diffuse alors vers le cœur des gouttes plus dilué. Ainsi, les enzymes diffusant dans des suspensions concentrées de CNC restent « collées » à leur surface et diffusent donc moins loin et moins vite que dans des suspensions CNC-XG (figure 2, f).

Figure 2. a, b) aspect en lumière polarisée de gouttes de CNC et de CNC-XG, respectivement ; c), d) répartition de l’enzyme dans les mêmes gouttes, localisée par microscopie à fluorescence DUV ; e) profil de diffusion de l’enzyme dans des suspensions de CNC et CNC-XG, et f) représentation schématique de cette diffusion.

Ce résultat étonnant implique donc que la glucanase interagit plus fortement avec la cellulose nue qu’avec la cellulose couverte de XG. Il est important de noter que le XG choisi s’adsorbe « à plat » à la surface de la cellulose et n’est pas accessible à l’action enzymatique. Son influence sur le comportement de l’enzyme provient donc plutôt d’une compétition entre l’enzyme et le XG pour interagir avec la surface de cellulose. Cela souligne donc le rôle important de ce genre de XG adsorbé à plat dans la PCV, qui peut moduler la diffusion d’enzymes sans forcément en être le substrat.

Contact :  Isabelle Capron, Hugo Voisin

(1)     Voisin, H.; Bonnin, E.; Marquis, M.; Alvarado, C.; Lafon, S.; Lopez-Leon, T.; Jamme, F.; Capron, I. Interactions between Proteins and Cellulose in a Liquid Crystalline Media: Design of a Droplet Based Experimental Platform. Int. J. Biol. Macromol. 2023, 245 (January). https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125488.

(2)     Voisin, H.; Bonnin, E.; Marquis, M.; Alvarado, C.; Lafon, S.; Lopez-Leon, T.; Jamme, F.; Capron, I. Probing the Colloidal Behavior of a Cell Wall Polysaccharides-Degrading Enzyme in a Highly Constrained Model System. J. Colloid Interface Sci. 2025, 694 (February). https://doi.org/10.1016/j.jcis.2025.137685.

(3)     Voisin, H.; Vasse, A.; Bonnin, E.; Capron, I. Influence of Low-Molar-Mass Xyloglucans on the Rheological Behavior of Concentrated Cellulose Nanocrystal Suspensions. Biomacromolecules 2023, 24 (1), 358–366. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.2c01172.

(4)      Voisin, H.; Vasse, A.; Bonnin, E.; Cousin, F.; Capron, I. Tuning of the Chiral Nematic Phase of Cellulose Nanocrystals by the Adsorption of a Short Polymer on Their Surface. Cellulose 2023, 30 (13), 8299–8309. https://doi.org/10.1007/s10570-023-05385-4.